Soutenance de thèse: Sophie VINCENTI (9 décembre 2016)

Expression de l’hydroperoxyde lyase recombinante d’olive chez la bactérie Escherichia coli et chez la levure Pichia pastoris
Etude des relations structure-fonction de l’enzyme

L’hydroperoxyde lyase (HPL) est une enzyme présente chez les plantes supérieures et intervenant dans la voie métabolique de la lipoxygénase. Elle peut agir sur des 9- et/ou des 13-hydroperoxydes d’acide gras. Trois classes d’HPL sont distinguées selon leur régiospécificité de substrat : les 9-HPL, les 13-HPL et les 9/13-HPL, à double spécificité. Les molécules volatiles produites par l’action de cette enzyme sont responsables de l’odeur fraîche de l’herbe coupée dite « note verte » et sont très utilisées par les industries cosmétiques et agroalimentaires. Afin de répondre à la demande croissante en molécules à note verte naturelles, des systèmes de production utilisant une HPL recombinante sont développés. Ainsi, l’ADNc codant pour une 13-HPL d’olive a été cloné au laboratoire et l’enzyme (HPLwt) a été exprimée chez Escherichia coli. Dans le but d’améliorer la solubilité de l’enzyme, l’HPL dépourvue de peptide de transit chloroplastique (HPLdel) a également été produite. Les deux enzymes recombinantes ont été purifiées puis caractérisées biochimiquement. Elles présentent une activité maximale à pH 7,5 et à 25°C, et agissent plus efficacement sur le 13-hydroperoxyde d’acide linolénique. L’étude de la stabilité des enzymes a montré que la présence de glycérol 10% permet la conservation de l’activité de l’HPLwt et de l’HPLdel durant cinq semaines de stockage à -80°C. De plus, l’ajout de composés chimiques tels que le NaCl, le Na₂SO₄ et la glycine a permis d’augmenter l’activité enzymatique. Parallèlement, l’HPLwt et l’HPLdel ont été clonées et exprimées chez la levure Pichia pastoris. Les deux enzymes recombinantes n’ont pas pu être sécrétées dans le milieu extracellulaire mais ont été produites de manière intracellulaire. Une activité HPL maximale de 58 unités par litre de culture a été mesurée à 24h d’induction. Par ailleurs, notre étude s’est portée sur la compréhension des relations structure-fonction de l’HPL. A ce jour, aucune structure cristalline de l’HPL n’est disponible. La structure tridimensionnelle de la 13-HPL d’olive a donc été modélisée grâce à des méthodes computationnelles. L’analyse de ce modèle a notamment permis de localiser le site actif putatif de l’enzyme, puis, sur la base d’alignements de séquences protéiques de 9-, 13- et 9/13-HPL, des acides aminés potentiellement impliqués dans la régiospécificité ont été ciblés. Ainsi, une thréonine (T) en position 302 chez l’HPL d’olive et conservée chez les 13-HPL a été substituée par mutagénèse dirigée par une lysine (K) conservée chez les 9- et 9/13-HPL. Le mutant T302K a été exprimé chez Escherichia coli, puis purifié. Il présente une efficacité catalytique sur les 13-hydroperoxydes similaire à celle de l’HPL sauvage, mais montre également une activité, plus faible, sur le 9-hydroperoxyde d’acide linolénique